Inledning

Denna infärgningsmetod har fått sitt namn efter dansken Christian Gram. Han upptäckte metoden av en slump då han utarbetade färgningsmetoder. Han behandlade bakterier med en gentianaviolettlösning och därefter en jod-kaliumjodidlösning (Lugols lösning). Vid avfärgning med etanol försvann all färg från vissa bakterier (gramnegativa) men blev kvar hos vissa (grampositiva). Gram fann att man även kunde kontrastfärga bakterier med kristallviolett.
Denna infärgning används som en av de första metoder för att identifiera bakterier. Alla bakterier färgas av Lugols lösning. Vid färgningen bildas ett komplex mellan färgämnet och jod inuti cellväggen. Hos grampositiva bakterier, med mycket tjock och tät cellvägg, hålls färgkomplexet kvar medan den tunnare och porösare gramnegativa cellväggen lättare kan tvättas ut med etanol.

Material

1. Kristallvilolett i droppflaska
2. Lugols lösning i droppflaska
3. Aceton-alkohol i droppflaska
4. Saffraninlösning i droppflaska
Bakterier: Bacillus subtilis (grampositiva), Echerichia coli (gramnegativa)
Ev. okänd bakterie.

Utförande

Det kan vara lämpligt att testa sin okända bakterie mot referensbakterierna på samma objektglas.
Lägg den okända i mitten och en grampositiv och en gramnegativ på var sin sida.

1. En liten droppe vatten placeras mitt på ett rent objektglas.

2. Ta lite bakteriemassa med en platinaögla och suspendera (lös upp) i   
     vattendroppen.
3. Lufttorka preparatet i 37-50 ⁰C
4. Fixera preparatet genom att föra objektglaset, med bakteriesidan uppåt,
    försiktigt 4-5 gånger genom brännarens sparlåga.
5. Täck bakterierna med kristallviollett och låt verka 1 minut.
6. Skölj försiktigt bort färgen med Lugols lösning.
7. Täck bakterierna med mera Lugols lösning och låt verka i 1 minut. Häll
     av lösningen.
8. Avfärga i aceton-alkohol tills ingen blå färg längre löser sig. Det kan ta ca
    20-60 sekunder.
9. Skölj försiktigt i vatten i ca 5 sekunder.
10. Täck bakterierna med saffranin. Låt verka i 1 minut.
11. Skölj försiktigt i vatten ca 5 sekunder. Låt lufttorka.
12. Undersök i mikroskop

Till läraren

Gramnegativa bakterier förblir blåvioletta och grampositiva blir rosa till röda.

Underlag för riskbedömning   

Köp kristall violett färdig i lösning!

Kristall violett, 0,25% lösning: Fara Miljöskadligt, H350 Kan orsaka cancer.
Etanol: Brandfara, Fara, H225, H319
Ammoniumoxalatlösning, 1%: ej märkespliktig
Jod, <25%: ej märkespliktig
Kaliumjodid: Fara, Hälsofara, H372 Orsakar organskador genom lång eller upprepad exponering.
Lugols lösning för gramfärning: ej märkespliktigt
Aceton: Fara Brandfara, Skadlig, , EUH066 Upprepad kontakt kan ge torr hud eller hudsprickor. H225 Mycket brandfarlig vätska och ånga. H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H336 Kan göra att man blir dåsig eller omtöcknad.
Safranin, 0,25% lösning; ej märkespliktigt

Recept för reagens till Gramfärgning:

Stamlösning kristallviolett
Gentianaviolett eller kristallviolett, 15 g
96 % alkohol, 300 cm3

Kristallviolettlösning
Stamlösning 10 cm3
Destillerat vatten 40 cm3
1 % ammoniumoxalatlösning 50 cm3
FILTRERAS

Jodjodkaliumlösning enligt Lugol till Gramfärgning
Jod 1 g
Kaliumjodid 2 g
Destillerat vatten 300 cm3

Acetonsprit
Aceton 20 cm3
96 % alkohol 80 cm3

Safraninlösning
Safranin 0,25g/10 ml 95% sprit 10 cm3
Destillerat vatten 90 cm3

Denna demonstration finns under följande rubriker på KRC:s hemsida:

• Gymnasiet/ Kemi 2/ Biokemi / Laborationer
• Gymnasiet/ Tematiskt material/ Läkemedelskemi
• 7-9/ Kemin i vardagen och samhället/ Mat
• 7-9/ Kemins metoder och arbtessätt/ Systematiska udersökningar
• 7-9 Säkerhet/ Säkerhetslaborationer