Inledning     

Teori

Enzymerna lipaser, amylaser och proteaser tillverkas, förvaras och distribueras av bukspottkörteln. Enzymerna finns tillgängliga i ett inaktivt stadium sk. proenzym. Proenzymer töms ut i tolvfingertarmen efter signaler från magen och aktiveras vid ett visst pH. Amylas spjälkar polysackarider. 

Vid olika sjukdomar i bukspottkörteln kan den egna produktionen av enzymer helt eller delvis upphöra, vilket kan ge upphov till fettdiarré och risk för vitaminbrist. På apoteket kan man då köpa ett läkemedel Combizym som innehåller matsmältningsenzymerna. 

Syfte

Du ska testa vid vilket pH (2 eller 8) bukspott-amylas är aktivt och vilka bindningar det kan spjälka. Du ska använda tre olika polysackarider: 

a) Stärkelse med 1,4-a-glykosidisk bindning, 
b) Cellulosa med 1,4-b-glykosidisk bindning och 
c) Gummi arabikum, som består av polygalaktos med 1,3 bindningar

Reagenset DNSA = dinitrosalicylsyra påvisar med röd färg om det finns monosackarider. Om ingen nedbrytning har skett är färgen gul. Absorbansen läses vid 540 nm eller med ögat.

Material

• Buffertar: pH 2 av 0,5 mol/dm3 trietanolamin.HCl alternativt TRIS buffert pH 8 av sulfatbuffert (hälften 0,5 mol/dm3 natriumsulfat och hälften 0,5 mol/dm3 natriumvätesulfat)
• 1% löslig stärkelse
• 1% gummi arabikum
• Cellulosa av bomull eller filterpapper
• Amylaslösning av 50-70 mg amylas (porcine pancreas) i 100 cm3 vatten
• DNSA-reagens: Nygjord lösning av 1% 3,5-dinitrosalisylsyra, 30% Na,K-tartrat och 0,40 mol/dm3 NaOH

Risker vid experimentet

Denna riskbedömning är inte komplett. Den gäller de kemikalier under förutsättning att beskrivna koncentrationer och mängder används som samt metoden.  T.ex. Saltsyra är frätande. Använd skyddsglasögon.

En fullständig riskbedömning ges av undervisande läraren.

Utförande  

Gör i ordning 8 provrör enligt schemat nedanför 
Tillsätt amylas sist och ställ provrören i tempererat vatten på 300C i 30 minuter

Efter 30 minuter tillsätt 8 droppar DNSA-reagens och provrören ställs i kokande vattenbad i ca 10 minuter. Späd med 4cm³ vatten och läs av resultatet vid 540 nm eller se skillnader.
Skriv rapport! Gärna en bild!

Övrigt    

Eventuellt skrivs några frågeställningar för att eleven ska lättare kunna dra generella slutsatser.

Till läraren

Underlag för riskbedömning

DNSA Dinitrosalicylsyra: Fara, Frätande, Skadligt, H302 Skadligt vid förtäring., H318 Orsakar allvarliga ögonskador., H319 Orsakar allvarlig ögonirritation., H335 Kan orsaka irritation i luftvägarna. P260, P261, P264, P270, P271, P280, P301+P312, P304+P340, P310, P312, P321, P330, P337+P313 p362+P364 
TRIS buffert: ej märkespliktig
NaOH, Natriumhydroxid:, 0,40 mol/dm3: Frätande, Fara, H290, H314 och P280, P303+P361+P353, P304+P340+ P310, P305+P351+P338
Kaliumtartrat: ej märkespiktigt

Teori    

Kolhydratbestämning med dinitrosalicylsyrareagens är beskrivet av P.Bernfelt, Methods in enzymology, vol 1,1955 s.149.

Försöket ger röd färg (positivt för aktivt amylas) endast för provrör 3, dvs. stärkelse i pH 8

Tips    

Extra uppgift: Man kan utöka försöket genom att ta alla kolhydrater i både pH 8 och pH 2. Eller utöka försöket genom att testa vid flera pH-värden för stärkelselösningen.
pH 4 ättiksyrabuffert
pH 6 bärnstensyrabuffert
pH 10 natriumbikarbonatbuffert
pH 12 dinatriumfosfatbuffert 
Man erhåller då ett maximum för pH 6 eller 8. Men amylas har även en låg aktivitet vid pH 2 och kan ge svagt röd färg med DNSA-reagenset.

Detta material finns under följande rubriker på KRC:s hemsida: 

• Gymnasiet/ Tematisk material/ Läkemedelskemi
• Gymnasiet/ Kemi 2/ Biokemi/ Laborationer
• Gymnasiet/ Kemi 1/ Reaktioner/ Syror och baser/ Demonstrationer
• 7-9/ Kemin i vardagen och samhället/ Mat
• 7-9/ Kemins metoder och arbetssätt/ Systematiska undersökningar